Tissus fixés au formol et enrobés de paraffine (FFPE)

Les chercheurs et les cliniciens utilisent largement les blocs de tissus FFPE dans la recherche médicale et le diagnostic clinique. Ces blocs préservent la structure des tissus et les détails cellulaires pour un stockage à long terme. Ils constituent donc une source précieuse de tissus archivés qui peuvent être réanalysés à l'aide de techniques moléculaires.

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Blocs de tissus fixés à la formaline et paraffinés (FFPE)

Le FFPE est une méthode populaire de conservation des échantillons biologiques, en particulier dans les domaines de la pathologie, de la recherche et du diagnostic. Le processus comprend deux étapes clés :

Fixation à la formaline: Le tissu est placé dans du formol (une solution de formaldéhyde), qui maintient sa structure intacte et arrête la décomposition en stabilisant les protéines et les acides nucléiques.
Enrobage de paraffine: Après la fixation, le tissu subit une déshydratation et est infiltré de cire de paraffine. Le tissu est ainsi plus facile à conserver et à sectionner pour l'analyse microscopique.

Le tissu FFPE joue un rôle important en histopathologie, en particulier dans le diagnostic du cancer. Il permet une conservation à long terme à température ambiante, ce qui rend possible les études rétrospectives. Cependant, le formol provoque des liaisons croisées entre les biomolécules, ce qui complique l'extraction et l'analyse de l'ADN, de l'ARN et des protéines. Ces problèmes posent des défis à la recherche moléculaire, comme le séquençage et les études d'expression génétique.

Méthode d'emboîtement de blocs de tissus dans la paraffine

La procédure opératoire standard suivante pour les blocs de tissus inclus en paraffine est fournie par le Centre de ressources de la biobanque :

Procédure opérationnelle standard du CTRNet

Notes sur le prélèvement de tissus solides

Un pathologiste doit superviser l'obtention des tissus afin de garantir la bonne conservation du matériel de diagnostic. Les tissus solides, tels que les tumeurs, peuvent varier considérablement dans leur composition (par exemple, contenir des cellules néoplasiques, des cellules normales et de la nécrose), de sorte qu'une section histologique de chaque échantillon doit être examinée au microscope.

Éviter la contamination croisée, la déshydratation et la dessiccation.
Conserver les échantillons sur de la glace humide s'ils ne sont pas traités immédiatement.
Manipuler tous les échantillons humains comme des risques biologiques potentiels.

Facteurs préanalytiques affectant la qualité

Plusieurs facteurs peuvent affecter la qualité des tissus FFPE, ce qui a un impact sur leur utilisation dans la recherche et le diagnostic.

1. Processus de fixation

Type et concentration de formol: La concentration standard est de 4-10% de formol tamponné neutre. Les changements de concentration peuvent entraîner une sur-fixation ou une sous-fixation, ce qui affecte négativement l'analyse des tissus et des molécules.
Sous-fixation: Un temps trop court dans le formol entraîne une décomposition des tissus et une dégradation des acides nucléiques et des protéines.
Sur-fixation: Un séjour trop long dans le formol entraîne une réticulation excessive qui rend difficile l'extraction des biomolécules.
Temps de fixation: Un délai entre l'excision du tissu et la fixation permet la dégradation de l'ADN, de l'ARN et des protéines, il est donc essentiel de réduire ce délai au minimum.

2. Pénétration de la formaline

Épaisseur du tissu: Les échantillons de tissus épais peuvent empêcher le formol de pénétrer complètement, ce qui entraîne une fixation et une dégradation inégales. Les échantillons de tissus doivent avoir une épaisseur d'environ 4 à 5 mm pour garantir une bonne conservation.
Formaline Volume: La quantité de formol doit être au moins dix fois supérieure au volume du tissu pour assurer une diffusion efficace.

3. Emboîtement en paraffine

Température: L'inclusion de tissus à des températures élevées endommage les protéines et les acides nucléiques. L'idéal est d'effectuer l'inclusion à une température de 55-60°C.
Pureté de la paraffine: Les impuretés contenues dans la paraffine peuvent interférer avec la recherche moléculaire, il est donc important d'utiliser de la paraffine de haute pureté.
Qualité de l'intégration: Un enrobage incomplet ou de mauvaise qualité peut laisser des bulles d'air ou des lacunes, ce qui peut dégrader la qualité du tissu et affecter les coupes et les colorations ultérieures.

4. Facteurs de préfixation

Ischémie: La réduction de l'apport sanguin avant l'excision provoque des changements biochimiques qui dégradent les molécules. La réduction du temps entre la chirurgie et la fixation permet d'éviter ce problème.
Autolyse: Les retards de traitement peuvent entraîner une dégradation rapide des tissus. Une manipulation rapide et un transfert dans un fixateur sont essentiels.

5. Conditions de stockage

Durée du stockage: Avec le temps, les tissus FFPE subissent une dégradation de l'ADN et de l'ARN. Bien que les protéines soient plus stables, elles peuvent également se dégrader avec le temps.
Température et humidité: Les blocs FFPE doivent être conservés à des températures stables et dans des conditions sèches. Une humidité élevée peut entraîner une dégradation de la paraffine ou la formation de moisissures, et les fluctuations de température peuvent provoquer des fissures dans les blocs de paraffine, ce qui endommage encore plus le tissu.
Oxydation: Au fil du temps, les tissus FFPE peuvent être exposés à des facteurs environnementaux tels que l'oxygène, qui peuvent causer des dommages oxydatifs, dégradant davantage les acides nucléiques et les protéines.

6. Type et état des tissus

Composition des tissus: Les différents types de tissus réagissent différemment à la fixation au formol. Par exemple, les tissus adipeux (par exemple, le tissu adipeux) peuvent ne pas se fixer aussi bien que d'autres types de tissus en raison de la faible pénétration du formol dans les zones riches en lipides. De même, les tissus très vascularisés peuvent être plus sensibles à l'autolyse.
État de la maladie: Les tissus malades ou nécrosés peuvent être plus difficiles à préserver en raison de la dégradation existante ou d'une mauvaise intégrité structurelle, ce qui peut exacerber les difficultés liées à la fixation dans le formol.

7. Manipulation et sectionnement

Microtomie et sectionnement: Une section incorrecte (par exemple, l'utilisation de lames émoussées ou une coupe trop épaisse) peut endommager le tissu, le rendant plus difficile à analyser à la fois en histopathologie et dans les essais moléculaires.
Contamination croisée: Il est essentiel de manipuler correctement les sections pour éviter toute contamination, en particulier dans les laboratoires très actifs.

8. Réhydratation et coloration

Qualité de la déparaffinisation: Lors de la réhydratation de tissus FFPE pour des applications en aval (par exemple, immunohistochimie ou analyse moléculaire), une déparaffinisation incomplète peut laisser des résidus de paraffine qui peuvent interférer avec les colorations et les analyses moléculaires.
Protocoles de coloration: La qualité de la coloration histologique ou immunohistochimique peut être affectée par la qualité de la fixation. Une mauvaise fixation peut entraîner une faible coloration ou une perte de détails morphologiques, ce qui a un impact sur l'utilisation du tissu à des fins de diagnostic et de recherche.

9. Méthodologie d'extraction

Qualité de l'extraction: Les protocoles utilisés pour extraire l'ADN, l'ARN ou les protéines des tissus FFPE doivent être optimisés pour faire face aux défis posés par la réticulation au formol et l'inclusion en paraffine. Si les protocoles d'extraction ne sont pas optimisés, le rendement et la qualité des biomolécules peuvent être faibles, ce qui limite l'utilité du tissu dans les applications en aval.
Fragmentation de l'acide nucléique: La fragmentation de l'ADN et de l'ARN induite par le FFPE peut varier en fonction des conditions de fixation. Des acides nucléiques plus courts et plus fragmentés peuvent constituer un défi pour les techniques moléculaires telles que la PCR ou le séquençage de nouvelle génération.

10. Artéfacts introduits par la fixation

Modifications chimiques: La fixation au formol peut induire des modifications chimiques de l'ADN, telles que la formation d'adduits méthylol ou des changements oxydatifs, qui peuvent interférer avec les résultats de l'amplification PCR ou du séquençage.
Réticulation des protéines: La réticulation au formaldéhyde peut masquer les épitopes des protéines, ce qui complique la coloration immunohistochimique. La récupération des épitopes induite par la chaleur (HIER) est souvent nécessaire mais peut ne pas restaurer complètement l'antigénicité de certaines protéines.

Conclusions

Pour garantir des tissus FFPE de haute qualité à des fins de recherche et de diagnostic, il est important de contrôler soigneusement les facteurs pré-analytiques (tels que le temps de fixation et la durée de fixation), d'optimiser les protocoles de manipulation et d'encastrement, et de conserver les échantillons dans des conditions appropriées. En outre, des méthodes d'extraction et d'analyse validées sont nécessaires pour surmonter les défis posés par la réticulation et la dégradation induites par la fixation.

Études moléculaires à partir de tissus FFPE

Le tissu FFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded) est une méthode largement utilisée en recherche biomédicale et en diagnostic clinique pour préserver les échantillons biologiques. À l'origine, les chercheurs ont développé le FFPE pour préserver la structure des tissus pour l'histopathologie, mais il est devenu depuis une ressource précieuse pour les études moléculaires, y compris l'analyse de l'ADN, de l'ARN et des protéines. Vous trouverez ci-dessous un aperçu de ses avantages et de ses inconvénients :

1. Études sur l'ADN

Les chercheurs utilisent fréquemment les tissus FFPE pour l'extraction et l'analyse de l'ADN, en particulier dans les domaines de la génomique et de la recherche sur le cancer. L'ADN reste relativement stable dans les conditions de conservation des tissus FFPE.

Avantages

Les chercheurs peuvent archiver les échantillons FFPE pendant de nombreuses années, ce qui permet de réaliser des études rétrospectives.
Ils peuvent également effectuer le séquençage du génome entier et des panels de gènes ciblés sur l'ADN dérivé du FFPE, ce qui permet d'étudier les mutations génétiques, les variations du nombre de copies et les changements épigénétiques dans des maladies telles que le cancer.
En outre, les techniques basées sur la PCR, telles que la qPCR, la PCR spécifique à la méthylation et le séquençage de nouvelle génération (NGS), fonctionnent efficacement avec l'ADN extrait des tissus FFPE.

Défis

Cependant, le processus de fixation entraîne souvent une fragmentation de l'ADN et des modifications chimiques, comme la réticulation avec des protéines, ce qui complique l'analyse.
Pour y remédier, les chercheurs ont besoin de protocoles d'extraction spécialisés afin de garantir un ADN de haute qualité et de minimiser la dégradation.

2. Études sur l'ARN

Si les tissus FFPE conviennent bien aux études sur l'ADN, l'analyse de l'ARN pose davantage de problèmes en raison de son instabilité et de sa tendance à se dégrader au cours de la fixation.

Avantages:

Malgré ces difficultés, les chercheurs ont réussi à établir des profils d'expression de l'ARNm et à réaliser des analyses d'ARN-seq sur de l'ARN extrait d'échantillons FFPE. Pour résoudre le problème de la dégradation, ils modifient les protocoles en utilisant des longueurs de lecture plus courtes pour l'ARN-seq.
L'analyse des microARN est une autre application courante, car les microARN sont plus petits et plus résistants à la dégradation que les ARNm.

Défis:

Malheureusement, la fixation au formol entraîne généralement une fragmentation de l'ARN, de sorte que seuls de courts fragments d'ARN sont récupérables.
La réticulation entre l'ARN et les protéines complique encore la récupération de l'ARN. Pour obtenir de l'ARN utilisable, les chercheurs ont souvent recours à des kits d'extraction d'ARN spécialisés et à des protocoles d'amplicons courts.

3. Études sur les protéines

Les tissus FFPE sont également largement utilisés en protéomique et en immunohistochimie (IHC), qui reste l'un des outils de diagnostic clinique les plus courants.

Avantages :

Grâce à l'IHC, les chercheurs peuvent localiser les protéines dans les coupes de tissus, fournissant ainsi des informations spatiales cruciales sur l'expression des protéines.
En outre, la protéomique basée sur la spectrométrie de masse a été appliquée aux échantillons FFPE, bien qu'elle en soit encore aux premiers stades de développement.

Défis :

Cependant, la fixation au formol peut altérer la structure des protéines, ce qui rend plus difficile la détection d'épitopes spécifiques par des techniques telles que l'IHC ou le Western blotting.
C'est pourquoi les chercheurs utilisent souvent des méthodes de récupération des antigènes pour inverser les modifications chimiques et restaurer l'antigénicité des protéines.

4. Études épigénétiques

Les tissus FFPE fournissent des données précieuses pour l'étude des changements épigénétiques, tels que la méthylation de l'ADN et les modifications des histones.

Avantages :

Les chercheurs bénéficient des tissus FFPE lorsqu'ils étudient des échantillons de patients archivés, ce qui leur permet d'explorer les changements épigénétiques liés au cancer, ainsi que la biologie du développement.
En outre, ils peuvent appliquer des techniques telles que la PCR spécifique à la méthylation et le séquençage au bisulfite à l'ADN provenant d'échantillons FFPE.

Défis :

Comme pour d'autres études sur les acides nucléiques, la fragmentation de l'ADN causée par la fixation pose des problèmes, et les chercheurs doivent en tenir compte lors de l'extraction et du traitement.

5. Conclusion

Pour garantir la qualité des tissus FFPE destinés à la recherche et au diagnostic, il est essentiel de gérer les facteurs pré-analytiques, d'optimiser les protocoles de traitement et d'utiliser des méthodes d'analyse moléculaire validées. Bien que des défis subsistent, les échantillons FFPE continuent de fournir des données précieuses pour la recherche clinique.

Références

Bass BP, Kelly B Engel, Sarah R Greytak, Helen M Moore. Une revue des facteurs pré-analytiques affectant l'analyse moléculaire, protéique et morphologique des tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) : connaissez-vous bien votre spécimen FFPE ? Arch Pathol Lab Med. 2014 Nov;138(11):1520-30.

Engel KB, Moore HM. Effets des variables pré-analytiques sur la détection des protéines par immunohistochimie dans les tissus fixés au formol et inclus dans la paraffine. Arch Pathol Lab Med. 2011 May;135(5):537-43.

Hedegaard J, et al. Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue. PLoS One. 2014 May 30;9(5):e98187. doi : 10.1371/journal.pone.0098187. PMID : 24878701 ; PMCID : PMC4039489.

Sadeghipour A., Babaheidarian P. (2019) Making Formalin-Fixed, Paraffin Embedded Blocks. In : Yong W. (eds) Biobanking. Méthodes en biologie moléculaire, vol 1897. Humana Press, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8935-5_22.

Srinivasan M, Sedmak D, Jewell S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 2002 Dec;161(6):1961-71. doi : 10.1016/S0002-9440(10)64472-0. PMID : 12466110 ; PMCID : PMC1850907.

van Maldegem, et al. Effects of Processing Delay, Formalin Fixation, and Immunohistochemistry on RNA Recovery From Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Sections. Diagnostic Molecular Pathology 17(1):p 51-58, mars 2008. | DOI : 10.1097/PDM.0b013e31814b8866

Extraction d'ADN et d'ARN à partir d'échantillons biologiques de tissus fixés au formol et enrobés de paraffine. NCI Biospecimen Evidence-Based Practices (BEBP).

La plateforme Biosample Hub permet aux entreprises biotechnologiques et pharmaceutiques d'accéder à des échantillons et à des données cliniques fiables.